ইএলএসডি ডিটেক্টর সহ ওয়ায়েল হাই পারফরম্যান্স তরল ক্রোম্যাটোগ্রাফ দ্বারা স্পেকটিনোমাইসিনের নির্ধারণ
2025-10-16
ইভাপোরেটিভ লাইট-স্ক্যাটারিং ডিটেক্টর (ইএলএসডি) হল একটি অভিনব ভর আবিষ্কারক যার তাত্ত্বিক প্রযোজ্য যে কোনও যৌগ যা গ্যাসীয় কণা তৈরি করতে পারে। ফার্মাকোপিয়ার 2025 সংস্করণ 100 টিরও বেশি ওষুধের জাত বিশ্লেষণ এবং গুণমান নিয়ন্ত্রণের জন্য ইভাপোরেটিভ লাইট-স্ক্যাটারিং ডিটেকশন (ইএলএসডি) ব্যবহার নির্দিষ্ট করে। অনুশীলনে, ইএলএসডি প্রায়শই অতিবেগুনী (ইউভি) শোষণহীন যৌগগুলিতে প্রয়োগ করা হয়, যেমন অ্যাস্ট্রাগালোসাইড, কার্বোহাইড্রেট, অ্যামিনোগ্লাইকোসাইডস এবং কোলেস্টেরল, প্রায়শই UV এবং ফ্লুরোসেন্স ডিটেক্টরের পরিপূরক সনাক্তকরণ পদ্ধতি হিসাবে কাজ করে। যাইহোক, ELSD ফলাফল মোবাইল ফেজ রচনা, জৈব দ্রাবক ঘনত্ব, ইলুশন মোড এবং নেবুলাইজেশন অবস্থা সহ একাধিক কারণ দ্বারা প্রভাবিত হয়। অতএব, সঠিক এবং সামঞ্জস্যপূর্ণ বিশ্লেষণাত্মক ফলাফল নিশ্চিত করার জন্য, ফলাফলের উপর এই কারণগুলির প্রভাব মূল্যায়ন করা অপরিহার্য।
এই গবেষণাটি, 2025 ফার্মাকোপিয়ার পার্ট II থেকে স্পেকটিনোমাইসিন হাইড্রোক্লোরাইডের জন্য বিশ্লেষণাত্মক পদ্ধতির উল্লেখ করে এবং ICH QbD নীতি দ্বারা পরিচালিত, বিশ্লেষণাত্মক অবস্থার স্ক্রীন এবং অপ্টিমাইজ করার জন্য একটি অর্থোগোনাল পরীক্ষামূলক নকশা নিযুক্ত করেছে।
চিত্র 1 স্পেকটিনোমাইসিন হাইড্রোক্লোরাইড
2. যন্ত্র এবং পদ্ধতি
এই গবেষণায়, ওয়েয়েলের LC3200 সিরিজ HPLC সিস্টেম ব্যবহার করে ক্রোমাটোগ্রাফিক বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। ইন্সট্রুমেন্ট কনফিগারেশনের মধ্যে একটি চতুর্মুখী গ্রেডিয়েন্ট পাম্প, একটি অটোস্যাম্পলার, একটি কলাম কম্পার্টমেন্ট এবং একটি ইভাপোরেটিভ লাইট-স্ক্যাটারিং ডিটেক্টর অন্তর্ভুক্ত ছিল। সিস্টেম কন্ট্রোল এবং ডেটা অধিগ্রহণ/প্রসেসিং স্মার্টল্যাব 2.0 ক্রোমাটোগ্রাফি সফ্টওয়্যার দিয়ে সম্পাদিত হয়েছিল।
সারণি 1 HPLC শর্তাবলী
| ক্রোমাটোগ্রাফি কলাম | Nova Atom PC18 (4.6*250mm, 5μm) |
| মোবাইল ফেজ | 0.1mol/L Trifluoroacetic অ্যাসিড জলীয় দ্রবণ |
| প্রবাহের হার (মিলি/মিনিট) | 0.6 |
| কলাম তাপমাত্রা | 35 |
| ইনজেকশন ভলিউম (μL) | 20 |
| ELSD নেবুলাইজার তাপমাত্রা （°C） | 85 |
| ELSD ইভাপোরেটর তাপমাত্রা （°C） | 80 |
| ELSD সনাক্তকরণ তাপমাত্রা (°C) | 50 |
| গ্যাস প্রবাহের হার (SLM) | 0.2 |
3. সমাধান প্রস্তুতি
নমুনা সমাধান:স্পেকটিনোমাইসিন হাইড্রোক্লোরাইডের স্টক সলিউশন ক্লায়েন্ট দ্বারা 10 মিলিগ্রাম/মিলি লেবেলযুক্ত ঘনত্ব এবং 99.8% বিশুদ্ধতা প্রদান করা হয়েছিল।
0.1M Trifluoroacetic অ্যাসিড জলীয় দ্রবণ:1000mL ভলিউম্যাট্রিক ফ্লাস্কে 6.8mL ট্রাইফ্লুরোঅ্যাসেটিক অ্যাসিড অবিকল পিপেট করুন। বিশুদ্ধ জল দিয়ে চিহ্নে পাতলা করুন এবং ভালভাবে মেশান। অবশেষে, ব্যবহারের আগে 0.45μm সেলুলোজ মেমব্রেন ফিল্টারের মাধ্যমে সমাধানটিকে ভ্যাকুয়াম-ফিল্টার করুন।
স্ট্যান্ডার্ড সমাধান:স্টক দ্রবণটি যথাক্রমে 0.15, 0.25, 0.35, 0.50 এবং 0.70mg/mL এর ঘনত্ব সহ নমুনা সমাধান প্রস্তুত করতে বিশুদ্ধ জল দিয়ে পাতলা করা হয়েছিল। প্রতিটি দ্রবণ তারপর ব্যবহারের আগে একটি 0.45μm সেলুলোজ ঝিল্লি ফিল্টারের মাধ্যমে ফিল্টার করা হয়েছিল।
4. ফলাফল এবং আলোচনা
চাইনিজ ফার্মাকোপিয়া স্পেকটিনোমাইসিন হাইড্রোক্লোরাইড এন্ট্রির অধীনে সম্পর্কিত পদার্থ এবং মূল উপাদানের বিষয়বস্তু বিশ্লেষণের জন্য অভিন্ন ক্রোমাটোগ্রাফিক অবস্থা নিযুক্ত করে। পদ্ধতিটি বলে যে "ডিটেক্টরটি প্রকৃত পরিস্থিতির উপর ভিত্তি করে কনফিগার করা যেতে পারে।" অধ্যয়নের সময়, ELSD3260-এর যন্ত্রগত বৈশিষ্ট্য, বিশ্লেষণী পদ্ধতির প্রয়োজনীয়তা এবং প্রাসঙ্গিক সাহিত্য বিবেচনা করে, একাধিক পরীক্ষামূলক পরামিতি (টেবিল 2 এবং 3) স্ক্রীন করার জন্য একটি প্ল্যাকেট-বর্মন পরীক্ষামূলক নকশা নিযুক্ত করা হয়েছিল। পরবর্তীকালে, একটি বক্স-বেহেনকেন ডিজাইন (টেবিল 4) ইএলএসডি ডিটেক্টরের পিক এরিয়া প্রতিক্রিয়া অপ্টিমাইজ করার জন্য ব্যবহার করা হয়েছিল।
সারণী 2 প্লাকেট-বর্মন পরীক্ষামূলক নকশা
| না. | প্রবাহের হার (মিলি/মিনিট) | কলামের তাপমাত্রা (°সে) | নেবুলাইজার তাপমাত্রা （°C） | বাষ্পীভবন তাপমাত্রা （°C） | সনাক্তকরণ তাপমাত্রা (°C) | গ্যাস প্রবাহের হার (SLM) | পোস্ট-কলাম ক্ষতিপূরণ |
| 1 | 0.8 | 35 | 60 | 50 | 50 | 0.4 | না |
| 2 | 0.6 | 35 | 50 | 60 | 50 | 0.6 | না |
| 3 | 0.6 | 30 | 60 | 60 | 50 | 0.4 | হ্যাঁ |
| 4 | 0.8 | 30 | 60 | 60 | 40 | 0.6 | না |
| 5 | 0.6 | 35 | 60 | 50 | 40 | 0.6 | হ্যাঁ |
| 6 | 0.8 | 30 | 50 | 50 | 50 | 0.6 | হ্যাঁ |
| 7 | 0.8 | 35 | 50 | 60 | 40 | 0.4 | হ্যাঁ |
| 8 | 0.6 | 30 | 50 | 50 | 40 | 0.4 | না |
সারণী 3 প্লাকেট-বর্মন পরীক্ষামূলক ফলাফলের আনোভা বিশ্লেষণ
| ভিন্নতার উৎস | সহগ | টি-মান | p-মান | তাৎপর্য |
| প্রবাহ হার | -6.687 | -8.10 | <0.01 | 2 |
| কলাম তাপমাত্রা | 0.191 | 0.22 | 0.824 | 6 |
| নেবুলাইজার তাপমাত্রা （°C） | 5.342 | ৬.২৯ | <0.01 | 3 |
| বাষ্পীভবন তাপমাত্রা （°C） | 4.135 | 4.87 | <0.01 | 4 |
| সনাক্তকরণ তাপমাত্রা (°C) | 0.171 | 0.21 | 0.842 | 7 |
| গ্যাস প্রবাহের হার (SLM) | -10.381 | -12.23 | <0.01 | 1 |
| পোস্ট-কলাম ক্ষতিপূরণ | -2.559 | -3.02 | <0.01 | 5 |
সারণি 3 থেকে দেখা যায়, গ্যাস প্রবাহের হার, মোবাইল ফেজ প্রবাহ হার, এবং পোস্ট-কলাম ক্ষতিপূরণ নেতিবাচক প্রভাব দেখিয়েছে। বিশেষত, গ্যাস প্রবাহের হার এবং মোবাইল ফেজ প্রবাহ হার হ্রাস করা, পোস্ট-কলাম ক্ষতিপূরণ অক্ষম করার সাথে, ক্রোমাটোগ্রাফিক পিক প্রতিক্রিয়া বৃদ্ধি করতে পারে। যাইহোক, মোবাইল ফেজ প্রবাহের হার হ্রাসের ফলে শিখর প্রসারণ বৃদ্ধি এবং সনাক্তকরণের সংবেদনশীলতা হ্রাস পেতে পারে। অতএব, প্রবাহ হার মান পদ্ধতির সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ বজায় রাখা হয়েছিল। কলাম তাপমাত্রা এবং সনাক্তকরণ তাপমাত্রা ইতিবাচক প্রভাব প্রদর্শন করলেও, তারা উল্লেখযোগ্যভাবে প্রতিক্রিয়া মান উন্নত করেনি। ফলস্বরূপ, পরবর্তী অধ্যয়নগুলি গ্যাস প্রবাহের হার, নেবুলাইজার তাপমাত্রা এবং বাষ্পীভবনের তাপমাত্রা অপ্টিমাইজ করার উপর ফোকাস করবে।
প্রতিক্রিয়া মানের উপর গ্যাস প্রবাহের হার, নেবুলাইজার তাপমাত্রা এবং বাষ্পীভবন তাপমাত্রার প্রভাবগুলি একটি প্রতিক্রিয়া পৃষ্ঠ পদ্ধতি কাঠামোর মধ্যে একটি বক্স-বেহেনকেন পরীক্ষামূলক নকশা নিয়োগ করে তদন্ত করা হয়েছিল। পরীক্ষামূলক নকশা সারণি 4 এ উপস্থাপিত হয়।
সারণি 4 বক্স-বেহেনকেন পরীক্ষামূলক নকশা
| না. | গ্যাস প্রবাহের হার (SLM) | নেবুলাইজার তাপমাত্রা （°C） | বাষ্পীভবন তাপমাত্রা （°C） |
| 1 | 0.15 | 75 | 80 |
| 2 | 0.15 | 85 | 80 |
| 3 | 0.25 | 75 | 80 |
| 4 | 0.25 | 85 | 80 |
| 5 | 0.15 | 80 | 75 |
| 6 | 0.15 | 80 | 85 |
| 7 | 0.25 | 80 | 75 |
| 8 | 0.25 | 80 | 85 |
| 9 | 0.2 | 75 | 75 |
| 10 | 0.2 | 75 | 85 |
| 11 | 0.2 | 85 | 75 |
| 12 | 0.2 | 85 | 85 |
| 13 | 0.2 | 80 | 80 |
স্পেকটিনোমাইসিন হাইড্রোক্লোরাইড সনাক্তকরণের শর্তগুলি রেসপন্স সারফেস মেথডলজি (চিত্র 2) ব্যবহার করে পিক এরিয়া ভ্যারিয়েশনের অনুকরণ করে এবং ইনস্ট্রুমেন্টাল প্যারামিটার রেঞ্জগুলি বিবেচনা করে নির্ধারণ করা হয়েছিল: নেবুলাইজার তাপমাত্রা 85°C, বাষ্পীভবন তাপমাত্রা 80°C, ডিটেক্টর তাপমাত্রা 50°C, এবং গ্যাস প্রবাহের হার 0.
A. পিক এলাকায় গ্যাস প্রবাহের হার এবং বাষ্পীভবনের তাপমাত্রার প্রভাব
বি. পিক এলাকায় গ্যাস প্রবাহ হার এবং নেবুলাইজার তাপমাত্রার প্রভাব
গ. পিক এলাকায় নেবুলাইজার তাপমাত্রা এবং বাষ্পীভবনের তাপমাত্রার প্রভাব
চিত্র 2 পিক এলাকায় তারতম্য
ইনজেকশন যথার্থতা
স্পেকটিনোমাইসিন হাইড্রোক্লোরাইডের স্টক সলিউশন 0.35mg/mL এ পাতলা করা হয়েছিল এবং ক্রোমাটোগ্রাম রেকর্ড করা নির্দিষ্ট ক্রোমাটোগ্রাফিক অবস্থার অধীনে পরপর ছয়টি ইনজেকশন সঞ্চালিত হয়েছিল। স্পেকটিনোমাইসিন হাইড্রোক্লোরাইড ক্রোমাটোগ্রাফিক পিকের জন্য ধরে রাখার সময় এবং শিখর অঞ্চলের আপেক্ষিক মান বিচ্যুতি (আরএসডি%) গণনা করা হয়েছিল। ফলাফল সারণি 5 এ দেখানো হয়েছে।
টেবিল 5 ইনজেকশন নির্ভুলতা পরীক্ষার ফলাফল
| না. | ধরে রাখার সময় (মিনিট) | পিক এরা (SU*s) |
| 1 | 7.625 | 259.124 |
| 2 | 7.615 | 245.223 |
| 3 | 7.618 | 270.250 |
| 4 | 7.608 | 237.267 |
| 5 | 7.627 | 254.977 |
| 6 | 7.613 | 255.548 |
| RSD (%) | 0.09 | ৪.৪৯ |
বিশেষত্ব
বিশ্লেষণাত্মক পদ্ধতি যাচাইকরণের উপর ICH Q2(R2) নির্দেশিকা এবং চীনা ফার্মাকোপিয়া সাধারণ অধ্যায় 〈9101〉 বিশ্লেষণাত্মক পদ্ধতি যাচাইকরণের নির্দেশিকা অনুসারে, অপ্টিমাইজ করা পদ্ধতিটি নির্দিষ্টতা, রৈখিক পরিসর, নির্ভুলতা এবং পুনরাবৃত্তিযোগ্যতার জন্য যাচাই করা হয়েছিল।
বিশুদ্ধ জল এবং নমুনা সমাধান (0.35 mg/mL) রেকর্ড করা ক্রোমাটোগ্রামের সমান্তরালে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। ফলাফলগুলি (চিত্র 3) বিশুদ্ধ জলের ক্রোমাটোগ্রামে স্পেকটিনোমাইসিন হাইড্রোক্লোরাইড ধরে রাখার সময় কোনও ক্রোমাটোগ্রাফিক শিখর দেখায়নি, যখন নমুনা দ্রবণে স্পেকটিনোমাইসিন হাইড্রোক্লোরাইডের শীর্ষটি সন্নিহিত শিখরগুলি থেকে বেসলাইন বিচ্ছিন্নতা অর্জন করেছে (R > 1.5)।
চিত্র 3 স্পেকটিনোমাইসিন হাইড্রোক্লোরাইড নমুনার বিশ্লেষণাত্মক ফলাফল (0.35mg/mL)
লিনিয়ার রেঞ্জ
স্ট্যান্ডার্ড দ্রবণ প্রস্তুতি পদ্ধতি অনুসারে স্পেকটিনোমাইসিন হাইড্রোক্লোরাইড স্টক দ্রবণের তিনটি সমান্তরাল নমুনা প্রস্তুত করুন, ক্রোমাটোগ্রাফিক অবস্থার অধীনে তাদের বিশ্লেষণ করুন এবং ক্রোমাটোগ্রামগুলি রেকর্ড করুন। ক্রোমাটোগ্রাফিক পিক এলাকা এবং সংশ্লিষ্ট ঘনত্ব ব্যবহার করে রিগ্রেশন বিশ্লেষণ করুন।
চিত্র 4 লিনিয়ারিটি পরীক্ষার ফলাফল (লগ-ট্রান্সফর্মড বনাম আনট্রান্সফর্মড)
সাহিত্য অনুসারে, ELSD প্রতিক্রিয়া মান এবং ঘনত্বের মধ্যে সম্পর্ক অরৈখিক, রিগ্রেশন বিশ্লেষণ [8,9,10] সম্পাদন করার আগে প্রতিক্রিয়া মান এবং ঘনত্ব উভয়ের লগারিদমিক রূপান্তর প্রয়োজন। পরীক্ষামূলক ডেটাতে লগারিদমিক রূপান্তর প্রয়োগ করার পরে, রৈখিক রিগ্রেশন বক্ররেখার পারস্পরিক সম্পর্ক সহগ 0.999 ছাড়িয়ে গেছে, যা লগারিদমিক রূপান্তর ছাড়া প্রাপ্ত ফলাফলের তুলনায় উল্লেখযোগ্যভাবে ভাল (চিত্র 4 এ দেখানো হয়েছে)।
নির্ভুলতা এবং পুনরাবৃত্তিযোগ্যতা
স্পেকটিনোমাইসিন হাইড্রোক্লোরাইড স্টক দ্রবণটি 0.25, 0.35 এবং 0.50mg/mL এর ঘনত্বে পাতলা করা হয়েছিল। প্রতিটি ঘনত্বের জন্য, তিনটি সমান্তরাল নমুনা প্রস্তুত করা হয়েছিল, নির্দিষ্ট ক্রোমাটোগ্রাফিক অবস্থার অধীনে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল এবং ক্রোমাটোগ্রামগুলি রেকর্ড করা হয়েছিল। বিষয়বস্তু রিগ্রেশন বক্ররেখা ব্যবহার করে গণনা করা হয়েছিল, এবং পুনরুদ্ধার এবং পুনরাবৃত্তিযোগ্যতা মূল্যায়ন করা হয়েছিল। ফলাফল সারণি 6 এ উপস্থাপন করা হয়।
সারণী 6 পুনরুদ্ধার পরীক্ষার ফলাফল
| না. | প্রকৃত মান (mg/Ml) | গণনা করা মান (mg/Ml) | পুনরুদ্ধার (%) | পুনরুদ্ধার RSD (%) |
| 1 | 0.25 | 0.252 | 100.8 |
1.36 |
| 2 | 0.25 | 0.251 | 100.4 | |
| 3 | 0.25 | 0.246 | 98.4 | |
| 4 | 0.35 | 0.348 | 99.4 | |
| 5 | 0.35 | 0.352 | 100.6 | |
| 6 | 0.35 | 0.344 | 98.3 | |
| 7 | 0.50 | 0.505 | 101.0 | |
| 8 | 0.50 | 0.513 | 102.6 | |
| 9 | 0.50 | 0.504 | 100.8 |
পরিমাণ নির্ধারণের সীমা (LOQ)
স্ট্রেপ্টোমাইসিন হাইড্রোক্লোরাইড স্টক দ্রবণকে 12μg/mL এর ঘনত্বে পাতলা করুন। ক্রোমাটোগ্রাফিক অবস্থার অধীনে নমুনা বিশ্লেষণ করুন এবং ক্রোমাটোগ্রাম রেকর্ড করুন। স্ট্রেপ্টোমাইসিন হাইড্রোক্লোরাইড ক্রোমাটোগ্রাফিক পিকের সংকেত-টু-শব্দ অনুপাত (S/N) গণনা করুন এবং এর পুনরাবৃত্তিযোগ্যতা নির্ধারণ করুন। ফলাফল সারণি 7 এ দেখানো হয়েছে।
সারণি 7 LOQ পরীক্ষার ফলাফল
| না. | এসএনআর | পিক এলাকা (SU*s) | পিক এরিয়া RSD (%) |
| 1 | 15.647 | 3.416 |
৮.৪৫ |
| 2 | 10.634 | 2.928 | |
| 3 | 15.728 | 3.145 | |
| 4 | 12.842 | 3.529 | |
