Wayeal LCMS-TQ9200 LC-MS/MS সিস্টেম দ্বারা তেল-বহনকারী ফসলে Aflatoxin B₁, একটি গ্রুপ 1 কার্সিনোজেন নির্ধারণ

আফলাটক্সিন বি₁প্রাথমিকভাবে দ্বারা উত্পাদিত একটি অত্যন্ত বিষাক্ত সেকেন্ডারি মেটাবোলাইট অ্যাসপারগিলাস ফ্লাভাসএবং অ্যাসপারগিলাস পরজীবী। আফলাটক্সিন পরিবারের মধ্যে, এটি সবচেয়ে শক্তিশালী বিষাক্ততা এবং বিস্তৃত বিতরণ প্রদর্শন করে। এটি অন্তঃকোষীয় ডিএনএ এবং আরএনএ সংশ্লেষণকে বাধা দিয়ে এবং লিভারের উপর অত্যন্ত লক্ষ্যবস্তু ক্ষতিকারক প্রভাব সহ প্রোটিন বিপাকের সাথে হস্তক্ষেপ করে তার বিষাক্ত প্রভাবগুলি প্রয়োগ করে।অন্যান্য মাইকোটক্সিন যেমন ওক্র্যাটক্সিন এবং প্যাটুলিনের সাথে তুলনা করে, আফলাটক্সিন বি₁অত্যন্ত বিষাক্ত এবং একটি সুপ্রতিষ্ঠিত কার্সিনোজেনিসিটি আছে। এটি একটি হিসাবে শ্রেণীবদ্ধ করা হয়েছে গ্রুপ 1 কার্সিনোজেনবিশ্ব স্বাস্থ্য সংস্থা (WHO) দ্বারা। চিনাবাদাম, ভুট্টা, বাদাম এবং উদ্ভিজ্জ তেলের মতো তেল-বহনকারী ফসলে এটি প্রায়শই সনাক্ত করা হয়, যা বিশ্বব্যাপী খাদ্য নিরাপত্তা নিয়ন্ত্রণের জন্য এটিকে একটি অগ্রাধিকার দূষক করে তোলে।

আফ্লাটক্সিন বি এর সাথে দূষণ₁সাধারণত ঘটে যখন তেল-বহনকারী ফসল রোপণ, ফসল সংগ্রহ বা সংরক্ষণের সময় উচ্চ তাপমাত্রা এবং উচ্চ আর্দ্রতার সংস্পর্শে আসে, যা ছত্রাকের বৃদ্ধিকে উৎসাহিত করে। তদুপরি, এর স্থিতিশীল রাসায়নিক বৈশিষ্ট্যের কারণে, আফলাটক্সিন বি₁প্রচলিত রান্নার তাপমাত্রা দ্বারা ধ্বংস করা যায় না, যার ফলে কৃষি পণ্য এবং প্রক্রিয়াজাত খাবারের অবশিষ্টাংশের সমস্যা দেখা দেয়।

একটি উচ্চ মাত্রার স্বল্পমেয়াদী ইনজেশন তীব্র বিষক্রিয়ার কারণ হতে পারে, গুরুতর পেটে ব্যথা, বমি, জন্ডিস এবং লিভার ব্যর্থতার মতো উপসর্গের সাথে উপস্থিত হতে পারে, যা গুরুতর ক্ষেত্রে মারাত্মক হতে পারে। দীর্ঘমেয়াদী কম ডোজ এক্সপোজার লিভারে জমা হতে পারে, দীর্ঘস্থায়ী লিভারের আঘাত যেমন হেপাটিক ফাইব্রোসিস এবং সিরোসিসকে প্ররোচিত করে এবং এমনকি প্রাথমিক লিভার ক্যান্সারকে ট্রিগার করতে পারে। শিশু, বয়স্ক এবং পূর্ব-বিদ্যমান লিভারের রোগে আক্রান্ত ব্যক্তিদের সহ কম রোগ প্রতিরোধ ক্ষমতা সম্পন্ন জনসংখ্যা আফ্লাটক্সিন বি-এর উচ্চ ঝুঁকিতে থাকে₁বিষক্রিয়া

চীনে, জাতীয় মান GB 2761-2017 (ন্যাশনাল ফুড সেফটি স্ট্যান্ডার্ড - খাবারে মাইকোটক্সিনের সর্বোচ্চ মাত্রা) আফলাটক্সিন বি-এর সর্বোচ্চ অবশিষ্টাংশের সীমা নির্দিষ্ট করে।₁বিভিন্ন ধরনের খাবারে। উপরন্তু, GB 5009.22-2016 (ন্যাশনাল ফুড সেফটি স্ট্যান্ডার্ড - খাবারে আফ্লাটক্সিন বি এবং জি নির্ধারণ)আফলাটক্সিন বি নির্ধারণের জন্য অফিসিয়াল বিশ্লেষণাত্মক পদ্ধতি সরবরাহ করে₁.

এই অ্যাপ্লিকেশন নোটটি অ্যাফ্ল্যাটক্সিন বি নির্ধারণের জন্য একটি আইসোটোপ ডিলিউশন লিকুইড ক্রোমাটোগ্রাফি-ট্যান্ডেম ভর স্পেকট্রোমেট্রি (এলসি-এমএস/এমএস) পদ্ধতির প্রতিষ্ঠার বর্ণনা করে।₁Wayeal LCMS-TQ9200 LC-MS/MS সিস্টেম ব্যবহার করে।

কীওয়ার্ড:ট্রিপল চতুর্ভুজ; আফলাটক্সিন বি₁; আইসোটোপ পাতলা তরল ক্রোমাটোগ্রাফি-ট্যান্ডেম ভর স্পেকট্রোমেট্রি।

1. যন্ত্র এবং বিকারক

1.1 উপকরণ কনফিগারেশন

সারণি 1 উপকরণ কনফিগারেশন তালিকা

1.2 বিকারক এবং মান

সারণি 2 বিকারক এবং মান

1.3 পরীক্ষার উপাদান এবং সহায়ক সরঞ্জাম

ঘূর্ণি মিক্সার

উচ্চ গতির সেন্ট্রিফিউজ

বিশ্লেষণাত্মক ভারসাম্য

সেন্ট্রিফিউজ

সলিড-ফেজ এক্সট্রাকশন (এসপিই) ম্যানিফোল্ড (ভ্যাকুয়াম পাম্প সহ)

নাইট্রোজেন বাষ্পীভবনকারী

শেকার

2. পরীক্ষা পদ্ধতি

2.1 সমাধান প্রস্তুতি

2.1.1 5 mmol/L অ্যামোনিয়াম অ্যাসিটেট সমাধান:0.39 গ্রাম অ্যামোনিয়াম অ্যাসিটেট ওজন করুন, এটি জলে দ্রবীভূত করুন এবং 1000 মিলিমিটারে পাতলা করুন। ভালো করে মিশিয়ে নিন।

2.1.1 মিথানল-অ্যাসিটোনিট্রিল সমাধান:মিথানলের 100mL সাথে 100mL acetonitrile যোগ করুন, তারপর ভালোভাবে মেশান।

2.2 নমুনা প্রিট্রিটমেন্ট

2.2.1 নমুনা নিষ্কাশন

একটি 2 মিমি অ্যাপারচার পরীক্ষা চালনির মাধ্যমে গমের আটা পাস করুন। একটি 50mL সেন্ট্রিফিউজ টিউবে নমুনার 5g ওজন করুন (0.01g থেকে সঠিক)। 100 যোগ করুনμআইসোটোপ অভ্যন্তরীণ স্ট্যান্ডার্ড ওয়ার্কিং সলিউশনের L (100ng/mL), ঘূর্ণি দ্বারা মিশ্রিত করুন এবং 30 মিনিটের জন্য দাঁড়াতে দিন। 20mL মিথানল-জল দ্রবণ (70+30, v/v), মেশানোর জন্য ঘূর্ণি যোগ করুন এবং একটি অরবিটাল শেকারে 20 মিনিটের জন্য ঝাঁকান। 10 মিনিটের জন্য 6000r/মিনিট এ সেন্ট্রিফিউজ করুন। পরবর্তী ব্যবহারের জন্য সুপারনাট্যান্ট সংগ্রহ করুন।

2.2.2 নমুনা পরিশোধন

একটি পাত্রে 4 মিলি সুপারনেট্যান্ট সঠিকভাবে স্থানান্তর করুন, পিবিএস-এ 1% ট্রাইটন এক্স-100 এর 23 মিলি যোগ করুন এবং ভালভাবে মেশান।

ইমিউনোঅফিনিটি কলামের আসল তরল সম্পূর্ণরূপে নিষ্কাশিত হওয়ার পরে, উপরের নমুনা দ্রবণটিকে একটি 50 মিলি সিরিঞ্জ ব্যারেলে স্থানান্তর করুন। প্রবাহের হার সামঞ্জস্য করুন যাতে নমুনা দ্রবণটি কলামের মধ্য দিয়ে 1-3 মিলি/মিনিট হারে স্থিরভাবে চলে যায়। নমুনা দ্রবণটি সম্পূর্ণরূপে নিষ্কাশন হওয়ার পরে, সিরিঞ্জের ব্যারেলে 2 × 10 মিলি জল যোগ করুন এবং একটি অবিচলিত প্রবাহ হারে ইমিউনোঅফিনিটি কলামটি ধুয়ে ফেলুন। জল সরে যাওয়ার পরে, ভ্যাকুয়াম পাম্প ব্যবহার করে কলামটি শুকিয়ে নিন।

ভ্যাকুয়াম সিস্টেম সংযোগ বিচ্ছিন্ন করুন। ইমিউনোঅফিনিটি কলামের নিচে একটি 10 ​​মিলি গ্র্যাজুয়েটেড টেস্ট টিউব রাখুন, 50 মিলি সিরিঞ্জ ব্যারেলটি সরিয়ে দিন এবং 1-3 মিলি/মিনিট নিয়ন্ত্রিত প্রবাহ হারে কলামটি নির্গত করতে 2 × 1 মিলি মিথানল যোগ করুন। তারপর একটি ভ্যাকুয়াম পাম্প ব্যবহার করে আবার কলাম শুকিয়ে নিন। সমস্ত ইলুয়েট টেস্টটিউবে সংগ্রহ করুন।50 ডিগ্রি সেলসিয়াসে নাইট্রোজেনের স্রোতের নীচে ইলুয়েটটিকে আলতো করে বাষ্পীভূত করুন শুষ্কতার কাছাকাছি। প্রাথমিক মোবাইল পর্বের 1 এমএল যোগ করুন, অবশিষ্টাংশ দ্রবীভূত করতে 30 সেকেন্ডের জন্য ঘূর্ণি করুন। একটি 0.22 μm মেমব্রেন ফিল্টারের মাধ্যমে ফিল্টার করুন এবং পরবর্তী ইনজেকশনের জন্য একটি অটোস্যাম্পলার শিশিতে ফিল্টার সংগ্রহ করুন।

2.3 পরীক্ষার শর্ত

2.3.1 তরল ক্রোমাটোগ্রাফি পদ্ধতি

কলাম: C18, 1.7μমি, 2.1×50 মিমি

মোবাইল ফেজ ফেজ: A: মিথানল-অ্যাসিটোনিট্রিল সমাধান; পর্যায় B: 5mmol/L অ্যামোনিয়াম অ্যাসিটেট দ্রবণ

প্রবাহের হার: 0.3 মিলি/মিনিট

কলামের তাপমাত্রা: 40°গ

ইনজেকশন ভলিউম: 3µL

2.3.2 ভর স্পেকট্রোমেট্রি পদ্ধতি

সারণি 3 যৌগিক ভর স্পেকট্রোমেট্রি পরামিতি

দ্রষ্টব্য: তারকাচিহ্ন (*) পরিমাণগত আয়ন নির্দেশ করে।

3. পরীক্ষার ফলাফল

3.1 স্ট্যান্ডার্ড ক্রোমাটোগ্রাম

আফলাটক্সিন বি এর সংকল্প₁এবং আইসোটোপ অভ্যন্তরীণ মান 13C17-অ্যাফ্লাটক্সিন বি₁5 মিনিটের মধ্যে সম্পন্ন হয়। চিত্র 1-এ যেমন দেখানো হয়েছে, উভয় বিশ্লেষকই পরীক্ষামূলক বিশ্লেষণের প্রয়োজনীয়তা পূরণ করে চমৎকার শিখর আকার এবং সন্তোষজনক প্রতিক্রিয়া দেখিয়েছেন।

চিত্র 1 Aflatoxin B এর ক্রোমাটোগ্রাম₁এবং আইসোটোপ ইন্টারনাল স্ট্যান্ডার্ড 13C17আমি-আফলাটক্সিন বি₁

3.2 লিনিয়ার রেঞ্জ

স্ট্যান্ডার্ড স্টক সলিউশনের একটি উপযুক্ত ভলিউম এবং মিশ্র আইসোটোপ অভ্যন্তরীণ স্ট্যান্ডার্ড ওয়ার্কিং সলিউশনকে সঠিকভাবে স্থানান্তরিত করা হয়েছিল এবং আফলাটক্সিন বি সহ স্ট্যান্ডার্ড ওয়ার্কিং সলিউশনের একটি সিরিজ প্রস্তুত করতে প্রাথমিক মোবাইল ফেজের সাথে পাতলা করা হয়েছিল।₁50, 20, 10, 5, 2, 1, এবং 0.5ng/mL এর ঘনত্ব। প্রতিটি সমাধান 2ng/mL ঘনত্বে আইসোটোপ অভ্যন্তরীণ মান ধারণ করে। এই মানগুলি ব্যবহার করে একটি ক্রমাঙ্কন বক্ররেখা তৈরি করা হয়েছিল। 0.5 এর রৈখিক পরিসরের উপরে-50ng/mL, এবং সংশোধনের পর 13C 17-aflatoxin B ব্যবহার করে₁অভ্যন্তরীণ মান হিসাবে, মাপা এবং নামমাত্র আফ্লাটক্সিন বি-এর মধ্যে বিচ্যুতি₁ঘনত্ব সর্বাধিক অনুমোদিত বিচ্যুতির মধ্যে ছিল। পারস্পরিক সম্পর্ক সহগ (R) 0.999 এর চেয়ে বেশি ছিল, চমৎকার রৈখিকতা নির্দেশ করে।

Fig 2 Aflatoxin B এর স্ট্যান্ডার্ড কার্ভ₁

3.3 পুনরাবৃত্তিযোগ্যতা

তিনটি ঘনত্বে (1, 10, এবং 20 ng/mL) স্ট্যান্ডার্ড সমাধানগুলি পরপর ছয়বার ইনজেকশন দেওয়া হয়েছিল। ফলাফল নীচের টেবিলে দেখানো হয়. ধারণ সময়ের আপেক্ষিক মান বিচ্যুতি (RSDs) এবং aflatoxin B এর নমুনার পরিমাণ₁নিম্ন, মাঝারি, এবং উচ্চ ঘনত্ব সবই ছিল 5% এর মধ্যে, পরীক্ষার প্রয়োজনীয়তা পূরণ করে।

সারণি 4 আফলাটক্সিন বি এর জন্য পুনরাবৃত্তিযোগ্যতা পরীক্ষা₁নিম্ন, মাঝারি এবং উচ্চ ঘনত্বে

3.4 স্পাইক পুনরুদ্ধার

আফলাটক্সিন বি₁5ng/mL এর চূড়ান্ত ঘনত্ব অর্জনের জন্য নমুনার মধ্যে আদর্শ সমাধানটি স্পাইক করা হয়েছিল। স্পাইকড নমুনাটি তখন এলসি-এমএস/এমএস দ্বারা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। পরপর ছয়টি ইনজেকশনের গড় ফলাফল ছিল 5.147ng/mL, যার RSD 1.954%। গণনাকৃত পুনরুদ্ধারের হার ছিল 102.94%, যা পরীক্ষার প্রয়োজনীয়তা পূরণ করে।

3.5 ফাঁকা অবশিষ্টাংশ

ক্রমাগত 20 এনজি/এমএল স্ট্যান্ডার্ড দ্রবণটি ইনজেকশন করার পরে, একটি খালি নমুনা পরবর্তীতে ক্যারিওভার মূল্যায়ন করার জন্য ইনজেকশন করা হয়েছিল। চিত্র 3 তে দেখানো হয়েছে, ফাঁকা নমুনায় কোনও বহন শনাক্ত করা হয়নি।

চিত্র 3 যৌগের ফাঁকা ক্রোমাটোগ্রাম

3.6 নমুনা পরীক্ষা

আফলাটক্সিন বি₁নমুনা A (চিত্র 4) এ সনাক্ত করা যায়নি।

Fig 4 Aflatoxin B এর ক্রোমাটোগ্রাম₁নমুনা এ

4. উপসংহার

এই গবেষণায়, অ্যাফ্ল্যাটক্সিন বি নির্ধারণের জন্য একটি আইসোটোপ ডিলিউশন লিকুইড ক্রোমাটোগ্রাফি-ট্যান্ডেম ভর স্পেকট্রোমেট্রি (এলসি-এমএস/এমএস) পদ্ধতি₁Wayeal LCMS-TQ9200 লিকুইড ক্রোমাটোগ্রাফি-ট্যান্ডেম ভর স্পেকট্রোমেট্রি সিস্টেম ব্যবহার করে প্রতিষ্ঠিত হয়েছিল। প্রাপ্ত তথ্য প্রমাণ করে যে সমস্ত ক্রোমাটোগ্রাফিক শিখরগুলি লেজ ছাড়াই ভাল শিখর আকৃতি প্রদর্শন করে। সংবেদনশীলতা পরীক্ষামূলক প্রয়োজনীয়তা পূরণ করে, এবং পারস্পরিক সম্পর্ক সহগ (R) 0.999 এর চেয়ে বেশি, রৈখিকতার মানদণ্ডকে সন্তুষ্ট করে। নিম্ন, মাঝারি এবং উচ্চ ঘনত্বে পুনরাবৃত্তিযোগ্যতা 5% এর মধ্যে, এবং উচ্চ-ঘনত্বের নমুনা ইনজেকশনের পরে কোনও সিস্টেম বহনযোগ্যতা পরিলক্ষিত হয় না। এই ফলাফলগুলি নির্দেশ করে যে পদ্ধতিটি, যখন Wayeal তরল ক্রোমাটোগ্রাফি-ট্যান্ডেম ভর স্পেকট্রোমেট্রি সিস্টেমের সাথে সজ্জিত হয়, লক্ষ্য নমুনাগুলির রুটিন গুণগত এবং পরিমাণগত বিশ্লেষণের প্রয়োজনীয়তাগুলি পূরণ করে৷