৬২/২০০০ শিশু ও ছোট বাচ্চাদের স্বাস্থ্য রক্ষা করুন! ওয়াইনি আয়ন ক্রোমাটোগ্রাফি সাত ধরণের মানব দুধ নির্ধারণ করে

প্রস্তাবনা

হিউম্যান মিল্ক অলিগোস্যাকারাইডস (HMOs) হলো অলিগোস্যাকারাইডসের একটি গোষ্ঠী যার পলিমারাইজেশনের মাত্রা ৩ এর বেশি নয়, যা স্বাভাবিকভাবে মানব দুধে উপস্থিত থাকে; ল্যাকটোজ এবং ফ্যাটের পরে এটি মানব দুধের তৃতীয় বৃহত্তম কঠিন উপাদান। এটি অন্ত্রের ফ্লরা নিয়ন্ত্রণ করে—বিশেষ করে শিশুর অন্ত্রে বিফিডোব্যাকটেরিয়া (Bifidobacteriaceae) কলোনাইজেশনকে উৎসাহিত করে—একই সাথে অন্ত্রের স্বাস্থ্য বজায় রাখে, রোগ প্রতিরোধ ক্ষমতা এবং মস্তিষ্কের বিকাশকে সমর্থন করে এবং সংক্রমণ-বিরোধী প্রভাব ফেলে, যা শিশুর বৃদ্ধিতে গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা পালন করে। ২০১৫ সালে মার্কিন যুক্তরাষ্ট্রে প্রথম HMO-সমৃদ্ধ শিশু ফর্মুলা চালু হওয়ার পর থেকে, বিশ্বব্যাপী HMO সমৃদ্ধ বিভিন্ন ধরণের শিশু ফর্মুলা, দুধ ও দুগ্ধজাত পণ্য, হজম-স্বাস্থ্য সম্পূরক এবং কার্যকরী খাদ্য বিক্রি হয়েছে। ১ জুন, ২০২৩ পর্যন্ত, মার্কিন যুক্তরাষ্ট্র এবং ইইউ ব্যবহারের জন্য সাতটি HMO অনুমোদন করেছে: ২'-ফুকোসিলল্যাকটোজ, ৩'-ফুকোসিলল্যাকটোজ, ডিফিউকোসিলল্যাকটোজ, ল্যাক্টো-এন-নিওটেট্রোজ, ল্যাক্টো-এন-টেট্রোজ, ৩'-সায়ালিলল্যাকটোজ এবং ৬'-সায়ালিলল্যাকটোজ।

সাধারণ HMO সনাক্তকরণ পদ্ধতির মধ্যে, লিকুইড ক্রোমাটোগ্রাফির জন্য সনাক্তকরণের আগে একটি ডেরিভেটাইজেশন বিক্রিয়া প্রয়োজন, এতে জটিল নমুনা প্রস্তুতি জড়িত এবং ডেরিভেটাইজেশন বিকারকগুলি প্রায়শই বিষাক্ত হয়; HMOs-এর তাপ-অস্থির প্রকৃতি LC-MS-এ কম প্রতিক্রিয়া এবং দুর্বল পুনরাবৃত্তির দিকেও পরিচালিত করে। এর বিপরীতে, কার্বোহাইড্রেটের জন্য অ্যামপেরোমেট্রিক সনাক্তকরণ সহ আয়ন ক্রোমাটোগ্রাফি সহজ নমুনা প্রস্তুতি, উচ্চ প্রতিক্রিয়া এবং ভাল পুনরাবৃত্তি প্রদান করে, যা HMO বিশ্লেষণের জন্য স্পষ্ট সুবিধা দেয়। এই অ্যাপ্লিকেশন নোটটি ম্যানুয়ালি প্রস্তুত সোডিয়াম হাইড্রোক্সাইড, সোডিয়াম অ্যাসিটেট এবং আল্ট্রাপিউর জলকে এলুয়েন্ট হিসাবে ব্যবহার করে এবং শিশু ফর্মুলায় HMOs নির্ধারণের জন্য WAYEAL IC6300 আয়ন ক্রোমাটোগ্রাফ ব্যবহার করে। পদ্ধতিটিতে সহজ নমুনা প্রস্তুতি, উচ্চ সংবেদনশীলতা এবং ভাল রৈখিকতা রয়েছে, যা খাদ্যে HMO সনাক্তকরণের জন্য একটি দরকারী রেফারেন্স প্রদান করে।

মূল শব্দ: আয়ন ক্রোমাটোগ্রাফ; হিউম্যান মিল্ক অলিগোস্যাকারাইডস; অ্যামপেরোমেট্রিক ডিটেক্টর।

১. যন্ত্রপাতি, সরঞ্জাম এবং বিকারক

১.১ বিকারক এবং মান

সারণী ১. বিকারক এবং মানের তালিকা

১.২ পরীক্ষাগার সামগ্রী এবং সহায়ক সরঞ্জাম

• ১.২.১ বিশ্লেষণাত্মক ভারসাম্য (০.১ মিলিগ্রাম পাঠযোগ্যতা);
• ১.২.২ থার্মোস্ট্যাটিক জল স্নান;
• ১.২.৩ সেন্ট্রিফিউজ;
• ১.২.৪ জলীয় পলিথারসালফোন (PES) মেমব্রেন ফিল্টার (০.৪৫ µm);
• ১.২.৫ আল্ট্রাপিউর জল;
• ১.২.৬ ভ্যাকুয়াম পরিস্রাবণ যন্ত্র;
• ১.২.৭ RP সলিড-ফেজ এক্সট্রাকশন (SPE) প্রি-ট্রিটমেন্ট কার্টিজ;
• ১.২.৮ ডিসপোজেবল সিরিঞ্জ (২০ মিলি, ৫ মিলি)।

২. পরীক্ষামূলক পদ্ধতি

২.১ দ্রবণ প্রস্তুতি

• ২.১.১ ২০০ মিলি-মোলার সোডিয়াম হাইড্রোক্সাইড দ্রবণ: ১০.৫ মিলি ৫০% NaOH পিঞ্চ করুন, ১০০০ মিলি জলে পাতলা করুন এবং ভ্যাকুয়ামের অধীনে ফিল্টার করুন।
• ২.১.২ ৭৫ মিলি-মোলার NaOH এবং ২৫০ মিলি-মোলার সোডিয়াম অ্যাসিটেটের মিশ্র দ্রবণ: ২০.৫১ গ্রাম সোডিয়াম অ্যাসিটেট সঠিকভাবে ওজন করুন, জলে দ্রবীভূত করুন এবং ১০০০ মিলি ভলিউমেট্রিক ফ্লাস্কে স্থানান্তর করুন; ১০০০ মিলি আল্ট্রাপিউর জল দিয়ে পাতলা করার জন্য ৫০% NaOH এর ৩.৯৫ মিলি সঠিকভাবে পিঞ্চ করুন এবং ভ্যাকুয়ামের অধীনে ফিল্টার করুন।
• ২.১.৩ ৩% সালফোসালিসিলিক অ্যাসিড দ্রবণ: ৩.০ গ্রাম সালফোসালিসিলিক অ্যাসিড ওজন করুন, জলে দ্রবীভূত করুন এবং ১০০ মিলি পর্যন্ত পাতলা করুন (তাজাভাবে প্রস্তুত করুন)।
• ২.১.৪ মিশ্র মান স্টক দ্রবণ: ২'-ফুকোসিলল্যাকটোজ, ৩'-ফুকোসিলল্যাকটোজ, ৩'-সায়ালিলল্যাকটোজ, ৬'-সায়ালিলল্যাকটোজ, ল্যাক্টো-এন-টেট্রোজ এবং ল্যাক্টো-এন-নিওটেট্রোজ এর প্রতিটির ৫ মিলিগ্রাম সঠিকভাবে ওজন করুন (০.১ মিলিগ্রামের নিকটতম), একটি ১০ মিলি ভলিউমেট্রিক ফ্লাস্কে রাখুন, জলে দ্রবীভূত করুন এবং ৫০০০ মিলিগ্রাম/লিটার মিশ্র স্টক প্রস্তুত করতে চিহ্ন পর্যন্ত পাতলা করুন। ডিফিউকোসিলল্যাকটোজের ১ মিলিগ্রাম (০.১ মিলিগ্রামের নিকটতম) আলাদাভাবে ওজন করুন, একটি ১০ মিলি ভলিউমেট্রিক ফ্লাস্কে রাখুন, দ্রবীভূত করুন এবং ১০০ মিলিগ্রাম/লিটার স্টক প্রস্তুত করতে চিহ্ন পর্যন্ত পাতলা করুন।
• ২.১.৫ মিশ্র মান কার্যকারী দ্রবণ: ২'-এফএল, ৩'-এফএল, ৩'-এসএল, ৬'-এসএল, এলএনটি, এলএনএনটি এবং ডিএফএল এর ০.৫, ২, ৪, ৬, ৮ এবং ১০ মিলিগ্রাম/লিটার এর মিশ্র কার্যকারী দ্রবণ প্রস্তুত করতে ভলিউমেট্রিক ফ্লাস্কে মিশ্র স্টক দ্রবণ (২.১.৪) সঠিকভাবে পিঞ্চ করুন এবং জল দিয়ে পাতলা করুন। ব্যবহারের আগে তাজাভাবে প্রস্তুত করুন।

২.২ নমুনা প্রস্তুতি

একটি ছোট বীকারে প্রায় ২.০ গ্রাম নমুনা ওজন করুন, ৫০ মিলি উষ্ণ জল (প্রায় ৫০°C) দিয়ে ভালভাবে মেশান, ৪০ মিলি ৩% সালফোসালিসিলিক অ্যাসিড দ্রবণ যোগ করুন, একটি ভলিউমেট্রিক ফ্লাস্কে স্থানান্তর করুন এবং ১০০ মিলি পর্যন্ত পাতলা করুন এবং ১০ মিনিটের জন্য সোনিক করুন। ফিল্টার পেপার দিয়ে ফিল্টার করুন বা সেন্ট্রিফিউজ করুন (১২,০০০ আর/মিনিট, ১৫ মিনিট)। নমুনা দ্রবণটি একটি আরপি এসপিই কার্টিজ এবং তারপরে একটি ০.৪৫ µm জলীয় মেমব্রেন ফিল্টারের মাধ্যমে পাস করুন; প্রথম ৩ মিলি ফেলে দিন এবং বিশ্লেষণের জন্য এলুয়েট সংগ্রহ করুন। ব্যবহারের আগে, ২০ মিলি মিথানল এবং তারপরে ১৫ মিলি জল দিয়ে আরপি এসপিই কার্টিজ কন্ডিশন করুন এবং ৩০ মিনিটের জন্য সমতা আনুন।

২.৩ পরীক্ষামূলক শর্তাবলী

২.৩.১ আয়ন ক্রোমাটোগ্রাফি শর্তাবলী

৩. ফলাফল

৩.১ রৈখিক পরিসীমা

প্রতিটি মিশ্র মান কার্যকারী দ্রবণের একটি উপযুক্ত অংশ বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। রৈখিক পরিসীমা ছিল ০.৫-১০ মিলিগ্রাম/লিটার; পরিমাপ করা এবং নামমাত্র ঘনত্বের মধ্যে বিচ্যুতি সর্বোচ্চ অনুমোদিত বিচ্যুতির মধ্যে ছিল, R² মানগুলি ০.৯৯৯ এর উপরে ছিল এবং সমস্ত উপাদান ভাল রৈখিকতা দেখিয়েছে।

সারণী ২. যৌগগুলির রৈখিক পরিসীমা

চিত্র ১. সাতটি HMO স্ট্যান্ডার্ডের ওভারলে করা ক্যালিব্রেশন ক্রোমাটোগ্রাম

৩.২ নমুনা পরীক্ষার ফলাফল

নমুনা ১ এবং ২ ১০-গুণ পাতলা করার পরে পরীক্ষা করা হয়েছিল। প্রতিটি সাতটি HMO-এর পরিমাণ নিম্নলিখিতভাবে গণনা করা হয়েছিল: X হল নমুনায় পরিমাণ (মিলিগ্রাম/১০০ গ্রাম); c হল ক্যালিব্রেশন কার্ভ থেকে নমুনা দ্রবণে ঘনত্ব (মিলিগ্রাম/লিটার); V হল স্থির আয়তন (মিলি); m হল নমুনার ভর (গ্রাম); f হল পাতলা করার ফ্যাক্টর। গণনাকৃত পরিমাণ (মিলিগ্রাম/১০০ গ্রাম) নিম্নরূপ:

চিত্র ২. নমুনা ১ এর ১০-গুণ পাতলা করা আয়ন ক্রোমাটোগ্রাম

চিত্র ৩. নমুনা ২ এর ১০-গুণ পাতলা করা আয়ন ক্রোমাটোগ্রাম

সারণী ৩. নমুনা পরীক্ষার ফলাফল

৩.৩ নির্ভুলতা

ক্যালিব্রেশন স্তরের চতুর্থ কার্যকারী দ্রবণটি ২.৩.১ এর অধীনে ছয়টি ধারাবাহিক ইনজেকশনে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। সাতটি HMO পরিমাণের RSD পুনরাবৃত্তি মূল্যায়নের জন্য গণনা করা হয়েছিল। নীচের ফলাফলগুলি ভাল পদ্ধতির নির্ভুলতা নির্দেশ করে।

৩.৩.১ স্ট্যান্ডার্ড পুনরাবৃত্তি নির্ভুলতা

পরীক্ষার ফলাফল:

চিত্র ৪. ক্যালিব্রেশন স্ট্যান্ডার্ড S4 এর স্বাধীন পুনরাবৃত্তিমূলক ইনজেকশনের ওভারলে করা ক্রোমাটোগ্রাম

সারণী ৪. স্ট্যান্ডার্ডের পুনরাবৃত্তি নির্ভুলতা

৩.৪ সনাক্তকরণ এবং পরিমাণ নির্ধারণের সীমা

LOD: স্ট্যান্ডার্ড দ্রবণের অংশগুলি একটি মিশ্র দ্রবণে পাতলা করা হয়েছিল যাতে ১০ µg/L ৩'-এফএল, ৩০ µg/L ডিএফএল, ৩০ µg/L ২'-এফএল, ২২ µg/L এলএনএনটি, ৬৭ µg/L এলএনটি, ৬৭ µg/L ৬'-এসএল এবং ১৬০ µg/L ৩'-এসএল থাকে; ২০টি সমান্তরাল নমুনা প্রস্তুত এবং বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।

LOQ: স্ট্যান্ডার্ড দ্রবণের অংশগুলি একটি মিশ্র দ্রবণে পাতলা করা হয়েছিল যাতে ৩০ µg/L ৩'-এফএল, ৮০ µg/L ডিএফএল, ৯০ µg/L ২'-এফএল, ৬৫ µg/L এলএনএনটি, ২০০ µg/L এলএনটি, ২০০ µg/L ৬'-এসএল এবং ৫০০ µg/L ৩'-এসএল থাকে; ছয়টি সমান্তরাল নমুনা প্রস্তুত এবং বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।

পরীক্ষার ফলাফল নিম্নরূপ:

সারণী ৫. সাতটি HMO-এর LOD এবং LOQ এর জন্য S/N ফলাফল

৩.৫ নির্দিষ্টতা

গ্লুকোজ, ফ্রুক্টোজ, সুক্রোজ এবং মল্টোজ স্ট্যান্ডার্ড দ্রবণের অংশগুলি (প্রতিটি ১০০ µL) একটি ১০ মিলি ভলিউমেট্রিক ফ্লাস্কে যোগ করা হয়েছিল এবং নমুনা ২ দ্রবণের সাথে ৬৭-গুণ পাতলা করে চিহ্ন পর্যন্ত পাতলা করা হয়েছিল। সাতটি HMO-এর পিকগুলির সাথে এই শর্করাগুলি হস্তক্ষেপ করে কিনা তা পরীক্ষা করার জন্য দ্রবণটি বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। নীচে দেখানো হয়েছে, চারটি শর্করার দুধের গুঁড়োতে সাতটি HMO নির্ধারণে কোনও উল্লেখযোগ্য হস্তক্ষেপ দেখায়নি।

চিত্র ৫. ক্যালিব্রেশন S6, নমুনা ২, এবং চারটি শর্করার স্ট্যান্ডার্ড দিয়ে স্পাইক করা নমুনা ২ এর ওভারলে করা ক্রোমাটোগ্রাম

৪. উপসংহার

এই বৈধতাটি খাদ্যদ্রব্যে HMOs নির্ধারণের পদ্ধতি যাচাই করার জন্য WAYEAL আয়ন ক্রোমাটোগ্রাফ ব্যবহার করেছে। ডেটা দেখায় যে সমস্ত ক্রোমাটোগ্রাফিক পিকগুলি টেইলিং ছাড়াই ভাল আকৃতির; ২'-এফএল, ৩'-এফএল, ডিএফএল, এলএনএনটি, এলএনটি, ৬'-এসএল এবং ৩'-এসএল সমস্ত ৬০ মিনিটের মধ্যে এলুট হয়; সংবেদনশীলতা জাতীয় মান প্রয়োজনীয়তা পূরণ করে; এবং রৈখিক সহগগুলি ০.৯৯৯ এর উপরে। স্ট্যান্ডার্ড এবং নমুনা উভয়ের পুনরাবৃত্তি ভাল। দুটি সায়ালিলল্যাকটোজ ব্যতীত, LOD এবং LOQ µg/L স্তরে রয়েছে। পদ্ধতিটির ভাল নির্দিষ্টতা রয়েছে, কোনও হস্তক্ষেপকারী অপদ্রব্য পাওয়া যায়নি এবং সামগ্রিকভাবে মান প্রয়োজনীয়তা পূরণ করে।